一.简介

A.细胞名称：小鼠畸胎瘤细胞（P19）

B.细胞来源：胚胎；畸胎癌

C.细胞形态：上皮细胞样

D.细胞数量：>1百万个

E.污染检测：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

F.包装规格：T25培养瓶或者1ml冻存管包装

G.完全培养基：89%MEMα＋7.5%BCS(bovine calf serum )+2.5%优质FBS＋1%双抗

H.细胞背景描述: 加拿大渥太华大学的Mc Burney 等在1982 年从雄性小鼠畸胎瘤中分离得到的 , 是一种能够在体外培养的多能干细胞, P19 细胞团经RA 诱导可分化成神经元、胶质细胞和纤维母细胞; 而经二甲基亚砜(DM SO ) 诱导则分化成心肌、骨骼肌和平滑肌细胞;在P19细胞向神经元分化的过程中，神经发育相关基因的表达模式基本模拟了正常小鼠神经发育过程, 因此, P19 目前被用作一个研究神经发育的体外模型。P19 细胞作为研究神经分化机制的模型, 显著区别于其他细胞系的四大特点是: ①它具有正常小鼠的二倍体核型, 细胞分裂快, 可在体外迅速大量扩增, 多次传代也不丧失其分化能力。②P19 细胞具有多种分化潜力, 不同诱导条件下可定向分化成不同类型的细胞, 种植到孕鼠囊胚中能分化成多种类型细胞。③根据P19 细胞诱导分化分阶段进行的特点, 能将神经分化的早期机制与参与突起延伸的机制分开研究。④该细胞易于转染, 且转染后仍能正常分化, 适于进行细胞基因研究。通过转染正常或突变的目的基因, 增强或抑制它们的表达水平可用于研究这些基因在神经分化中的作用。另外, 利用反义RNA 阻断内源蛋白的表达, 可用来观察这些蛋白在神经分化中的作用。

(references:1.张金平等. 全反式维甲酸体外诱导P19细胞向心肌方向分化.[J]中国组织化学与细胞化学杂志.2012.1， 2.梅宇钦等. 建立经优化的促P19鼠胚胎癌细胞神经分化模型.浙江大学学报（医学版）2012.04)。

J.细胞的发货方式：细胞发货运输可选择干冰运输或发送复苏存活细胞这两种方式

二.收到细胞后的处理：

1）收到细胞后的拍照:请检查冻存管或培养瓶的状况，若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。

2）收到细胞后的保存以及处理：A.若收到的是干冰运输的细胞，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；B.若收到的是复苏存活的细胞，收到后应继续生长培养，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

3）在显微镜下检查细胞生长状态时，最好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，这样能够准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10×和20×物镜下，刚收到细胞时请立即给细胞拍照，（10×，20×）各拍照2-4张以及培养瓶外观拍照2-4张并留存，有必要时,这些照片可以作为日后售后的依据。

4） 观察完细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

5）贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书上写的新配置好的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

6）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出培养瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书上写的新配置好的完全培养基）。

7）注意：如果培养瓶装的是运输培养基（灌液培养基），是不能再用来培养细胞的，请换用按照说明书上写的新配置好的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。

三.细胞培养操作

A.培养基及培养冻存条件：

1）完全培养基：89%MEMα＋7.5%BCS(bovine calf serum )+2.5%优质FBS＋1%双抗。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

B.复苏细胞、细胞传代、细胞冻存：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10⁶/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。

注意事项：

1. 收到细胞后，请立即拍照；若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。

2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

3.细胞用途：仅供科研使用。